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La biblioteca fu aperta al pubblico nel 1742 nei locali situati sotto la Specola astronomica, attualmente sede della Domus Galilaeana. Sin dal 1823 ha sede nel Palazzo della Sapienza, antica sede dello Studio pisano. I locali, rinnovati e modernizzati, non sono particolarmente significativi dal punto di vista artistico ed architettonico, tranne le due sale storiche, Sala lettura e Sala riservata, che mantengono scaffalature lignee.
Il nucleo originario, costituito dalla biblioteca privata del professore Giuseppe Averani (1662-1738), fu accresciuto con lasciti, doni di privati e con lo smembramento delle biblioteche delle Corporazioni religiose soppresse.
Risale al 1757 l’acquisto di circa seimila volumi appartenuti all’erudito fiorentino Anton Francesco Gori di interesse archeologico e antiquario. Nel 1771 furono poi assegnate alla biblioteca per volontà del Granduca numerose opere della Biblioteca Medicea-Palatina-Lotaringia. Con l’abolizione del Monastero dei Camaldolesi di San Michele in Borgo i manoscritti del padre Guido Grandi ne arricchirono il patrimonio. Ulteriore acquisizione settecentesca fu il piccolo ma prezioso fondo dell’Orto Botanico. Ottocenteschi sono fondi importanti e pregevoli tra i quali ricordiamo i manoscritti dell'egittologo e direttore della biblioteca Ippolito Rosellini, il fondo costituito a proprie spese dal direttore Giuseppe Piazzini dal 1820 al 1832, le più recenti biblioteche scientifiche di Filippo Corridi e Sebastiano Timpanaro, le collezioni mediche di Diomede Buonamici e Antonio Feroci e la raccolta storico-letteraria del professore Alessandro D'Ancona.
La biblioteca è l’istituto designato (D.M. 28.12.2007) alla gestione del materiale editoriale soggetto al Deposito legale per la provincia di Pisa.
Il suo patrimonio è costituito da 1389 manoscritti; 161 incunaboli; 702 Cinquecentine; 600000 volumi; 4357 periodici di cui 1030 correnti.