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Si tratta della prima raccolta delle opere di Shakespeare, Comedies, histories, & tragedies, pubblicata a Londra in formato in folio da Edward Blount e Isaac Jaggard nel 1623, sette anni dopo la morte del drammaturgo, a cura di due attori della sua compagnia, John Heminges e Henry Condell. Contiene trentasei testi, di cui diciotto stampati per la prima volta: tra questi The Tempest, Macbeth, As You Like It, Julius Caesar, Antony and Cleopatra, Measure for Measure, The Winter’s Tale. In mancanza di testimoni manoscritti, l'edizione costituisce la fonte primaria della produzione shakespeariana.
Si stima che il First Folio sia stato stampato in circa 750 copie. Ad oggi si contano 233 esemplari superstiti: alle 232 copie enumerate nel catalogo descrittivo del 2012, curato da Eric Rasmussen e Anthony James West, va aggiunto infatti il nuovo esemplare scoperto nel novembre 2014 in Francia, nella biblioteca di Saint Omer. L'esemplare dell'Universitaria è l'unico conservato in Italia e uno dei sei censiti in Europa, fuori d'Inghilterra.
Lo straordinario interesse del First Folio padovano è dovuto al fatto che tre testi, Measure for Measure, Macbeth e The Winter's Tale presentano annotazioni, riferibili a due diverse mani, che testimoniano l'appartenenza del volume ad una compagnia teatrale e il suo utilizzo come prompt-book per la messa in scena del Macbeth e delle due commedie.
Si notano tagli di intere scene, versi o parole, inquadrati da tratti di penna, e annotazioni che ripetono le didascalie, anticipandole di qualche linea e che costituiscono quello che si denomina plot, indicando le entrate dei personaggi, gli intervalli alla fine di ogni atto, le suppellettili sceniche, i suoni, come squilli di tromba, musiche, calpestio di cavalli, e talvolta anche i nomi degli attori, per lo più riportati con sigle: Mr. K., Mr. G., TS, Mr. Carl., il cui nome viene dato anche per esteso, Mr. Carlile, come quello di Mr. H<e>wit. I tentativi di identificare le sigle e i nomi con nomi di attori noti del periodo non hanno finora portato a conclusioni definitive. Le revisioni si dovrebbero comunque riferire a rappresentazioni tenute dopo il 1640.
L'esemplare si presenta mutilo del frontespizio e della carta a fronte con l'avviso al lettore, sostituiti da copie facsimilari. La legatura è stata completamente rifatta nel 1960: la legatura antica, di cui era stato disposto il recupero, non è stata finora rinvenuta. Secondo le testimonianze di alcuni studiosi, che hanno esaminato il volume prima dell'intervento, si trattava probabilmente di una legatura originale inglese in pelle marrone, rivestita internamente da fogli di un'opera di genealogia sacra. Conosciamo l'aspetto delle controguardie originali grazie alle riproduzioni pubblicate da Gwynne Blakemore Evans nel suo Shakespearean prompt-books of the seventeenth century, del 1960: si trattava di due frammenti ricavati da fogli, non ancora fascicolati, di un'edizione in 12°, con ogni probabilità John Speed, The genealogies recorded in the Sacred Scriptures, [S.l., F. Kingston, 1638?].
Le notizie finora riportate sul ritrovamento del volume presso la Biblioteca Universitaria sono state condizionate dalle dichiarazioni del giornalista John Mackinnon Robertson, il primo ad annunciare la 'scoperta' dell'esemplare del First Folio in un articolo su The Scotsman del 1895. Riprendendo quanto sostenuto da Robertson, anche Rasmussen e West, nel loro recente catalogo descrittivo affermano: “The Padua First Folio emerged from centuries of obscurity in 1895, when the university's librarian found it in a box of uncatalogued books”. In realtà l'opera, che presenta il timbro della Biblioteca Universitaria risalente al periodo dell'Impero austriaco, entrò in biblioteca probabilmente intorno agli anni Quaranta dell'Ottocento, con i volumi incamerati in seguito alle vicende seguite alle soppressioni delle corporazioni religiose di età napoleonica e al conseguente passaggio al Demanio delle librerie claustrali. Venne regolarmente schedata e collocata con la vecchia segnatura S.N., che indicava la Sala Nuova, un ambiente approntato presso la Sala dei Giganti, allora sede dell'Universitaria, per ospitare le nuove accessioni derivanti dalle librerie dei conventi soppressi. E' inoltre allo studio l'appartenenza del volume ad un gruppo di libri inglesi, anch'essi conservati presso l'Universitaria, che presentano caratteristiche simili e che forse potrebbero far luce sulle precedenti vicende del prezioso esemplare.