Nel gennaio del 1526, con il trattato di Madrid, Francesco I viene rimesso in libertà ma è costretto a cedere al vincitore tutti i territori contesi, a partire da Milano. Quindi, sfruttando le paure di vari stati italiani, timorosi della potenza crescenze di Carlo V, il sovrano francese promuove una alleanza anti-imperiale, la Lega di Cognac, che, nel maggio del 1526, unisce in un fronte comune con la Francia Roma, Venezia e Firenze.
L’imperatore, informato di queste manovre, protesta con Castiglione, al quale pure, in numerose lettere autografe, conferma la sua volontà di pace. Il nunzio apostolico, a causa delle oscillazioni perpetue e dei repentini cambiamenti nelle strategie del pontefice, si sente stretto in una morsa da cui gli risulta impossibile districarsi, e d’altro non gli è difficile intuire l’imminente rovina. In parte egli ignora le decisioni del papa, in parte queste contrastano con ciò che gli viene comunicato e con i suoi medesimi consigli, sicché, di fronte alle critiche crescenti presso gli umanisti della corte spagnola, imbevuti di idee riformatrici erasmiane e inclini alla polemica contro i costumi della curia romana, non ha strumenti per obiettare. La tensione fra Madrid e Roma è tale che la buonafede che egli continua a vedere nella persona dell’imperatore non porta ad alcun risultato. Alla fine di luglio del ’26, da Granada, al segretario di stato di Clemente VII, Nicolaus Schömberg, confessa di non avere più alcun margine di manovra: “Io ho parlato a lungo a Sua Maestà, e come io l’abbia trovato satisfatto, Vostra Signoria il può pensare. Duolsi molto, e se non si fosse fatto altro che la Lega, e che questa non paresse proprio indirizzata a dannificar lui, credo che non la senteria tanto. Ma dice che di costà gli scrivono che ’l papa gli vuol torre il eame di Napoli, scomunicarlo e privarlo dell’imperio. E di questo si risente Sua Maestà, parendogli non l’aver meritato,e, per quanto io veggo, è posto in voler prima perder quanto ei tene che venire sforzatamente a concordia non onorevole. Qui si fanno quelle provisioni che si può. Dio metta la mano in questo incendio e lo estingua, per sua misericordia” (B. Castiglione, Lettere, a cura di P. Serassi, II, Padova 1771, 60-61).